Funktionelle Analyse der Signalpeptidpeptidase Familie im Zebrafisch

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Funktion von SPP und weiteren Mitgliedernder SPP Familie. Als Tiermodell wurde hierzu der Zebrafisch, danio rerio, verwendet. SPP und ihre Homologen sind Membranproteine mit sieben bis zehn Transmembrandomänen. Alle Mitglieder dieser Familie weisen drei in der Evolution hoch konservierte Aminosäure Motive auf, YD, GxGD und PAL. Diese Motive sind von der intramembranären Aspartylprotease Presenilin, einem Bestandteil der γ-Sekretase, bekannt.

Expressionsanalysen an Zebrafischembryonen ergaben, dass die Transkripte aller drei Gene der SPP Familie im Zebrafisch maternal vererbt werden. Es zeigte sich, dass spp, sppl2 und sppl3 während der Embryogenese des Zebrafisches in frühen Stadien gleichmäßig ubiquitär exprimiert werden. In späteren Stadien ist die Expression dieser Gene besonders prominent im Bereich des zentralen Nervensystems.

In knock down Experimenten im Zebrafisch konnte gezeigt werden, dass alle drei Gene eine für die Embryonalentwicklung essentielle Funktion wahrnehmen. Dabei führt der Funktionsverlust von spp und sppl3 zu einem neurodegenerativen Phänotyp, während bei einem Funktionsverlust von sppl2 ein Zirkulationsdefekt mit Gerinnselbildung in der Schwanzvene auftritt. Dies lässt auf eine nicht redundante Funktion von spp und sppl3 verglichen mit sppl2 während der Embryonalentwicklung schließen.

Bei allen drei Genen der SPP Familie im Zebrafisch handelt es sich um intramembranäre Aspartylproteasen des GxGD Typs. Dies konnte durch Überexpression mutierter mRNA Konstrukte, in deren Translationsprodukt der Aspartylrest des GxGD Motivs durch ein Alaninrest ersetzt wird, gezeigt werden: Die Mutation des Aspartylrestes des GxGD Motivs führt zu einem Funktionsverlust der Protease, durch den sich die Phänotypen der knock down Experimente reproduzieren lassen.

Aus medizinischer Sicht ist die SPP Familie aus vier Gründen von großem Interesse. Der enzymatische Mechanismus der Substratspaltung weist bei SPP, SPPL2b und vermutlich weiteren Mitgliedern dieser Familie große Ähnlichkeit zum Presenilin der γ-Sekretase auf (Fluhrer & Haass, 2007). Die γ-Sekretase gilt im Kampf gegen die Alzheimer Krankheit als mögliches Ziel einer Protease Inhibitor Therapie. Es ist daher wichtig, zum einen eventuelle Unterschiede im Enzymmechanismus zur SPP Familie aufzudecken, um selektiv wirksame Inhibitoren herstellen zu können, zum anderen müssen die physiologischen Funktionen von SPP und SPPLs weiter aufgeklärt werden, um mögliche Nebenwirkungen durch Kreuzreaktionen von möglichen Alzheimer Therapeutika antizipieren zu können.

Die bekannten Funktionen von SPP und SPPL2a/b selbst bieten mögliche Einsatzgebiete gezielter Pharmakotherapie: Die Inhibition der SPP Funktion scheint eine interessante Option im Kampf gegen den Hepatitis C Virus (Ait-Goughoulte et al, 2006; Heimann et al, 2006; Hope et al, 2006; Majeau et al, 2005). Die physiologische Funktion von SPP und SPPL2a/b bei der Prozessierung von MHC Klasse Ia Signalpeptiden bzw. von TNFα weisen diesen Proteasen auch eine Rolle in immunologischen und inflammatorischen Prozessen zu (Fluhrer et al, 2006; Friedmann et al, 2006; Lemberg et al, 2001), die eventuell modulatorisch ausgenutzt werden könnte.

Die beobachteten Phänotypen in den knock down Experimenten machen den Zebrafisch zu einem vielversprechenden Versuchstier, um z.B. die Wirkung neuer Inhibitorsubstanzen auszutesten.